Исследование геномных ассоциаций. Почему люди падают в обморок?
8 (800) 302 43 71
+7 (343) 226 90 09

Исследование геномных ассоциаций идентифицирует локус в хромосоме 2q32.1, связанный с обмороком и коллапсом

1. Введение

Обморок определяется как преходящая потеря сознания из-за кратковременной глобальной церебральной гипоперфузии.1 Он характеризуется внезапным началом, короткой продолжительностью и спонтанным восстановлением.1,2 Обморок является распространенным заболеванием среди населения в целом и составляет примерно 1% всех посещений европейских отделений неотложной помощи.3 Это происходит чаще у женщин, чем у мужчин, при этом оценочные показатели заболеваемости варьируются от 2,6 до 19,5 на 1000 человеко-лет. Самый высокий уровень заболеваемости наблюдается у женщин в возрасте >80 лет.4,5 Обморок можно классифицировать на нервно-опосредованный рефлекторный обморок (нейрокардиогенный), обморок из-за ортостатической гипотензии и сердечный обморок. Рефлекторный обморок (вазовагальная обморок; VVS), который является подтипом нейроопосредованного рефлекторного обморока, является наиболее частым типом обморока.4 Общая смертность от обморока и коллапса, как сообщается, составляет 0,28% в период с 2000 по 2005 год в США, и самый высокий риск смертности наблюдался при сердечных обмороках.6

Предрасполагающие факторы к обмороку включают широкий спектр, начиная от опасных для жизни заболеваний, а также побочных эффектов фармакологических средств и заканчивая доброкачественными причинами.2,3 Обморок часто встречается у пациентов с основными сердечными заболеваниями, в частности при генетических сердечных аритмиях, например, синдромах длинного и короткого интервалов QT,7 Синдром Бругада,8 и катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия.9 При последнем обморок может быть единственным проявляющим симптомом. Поэтому необходимо улучшить понимание патофизиологических механизмов. Недавнее датское исследование симптомов, предшествующих внезапной смерти у молодых, показало, что обморок произошел за 24 ч до смерти у 17% жертв.10 Несмотря на высокую степень использования диагностических тестов, диагностический выход остается низким (30–48%).11

Исследования семейной агрегации ВВС преимущественно предполагают комплексное наследование,12 и исследования близнецов показали более высокие показатели конкордантности для VVS в монозиготных парах близнецов по сравнению с дизиготными парами близнецов.13

Предыдущие исследования, которые связывают генетические локусы с обмороком,14–16 пострадали от небольших размеров выборки(n ∼ 50–150) и не смогли воспроизвести. Исследование вариаций числа копий (CNV) показало, что сегменты CNV были длиннее у пораженных людей по сравнению с незатронутыми людьми.17

Проект UK Biobank имеет обширные фенотипические и генотипические данные о более чем 500 000 участников из общей популяции, что позволяет исследователям изучать общие черты. В настоящем исследовании мы использовали метаданные британского биобанка для изучения генетической основы, лежащей в основе обморока и коллапса.

2. Методы

2.1 Исследуемая популяция, Биобанк Великобритании

UK Biobank – это крупное, популяционное, проспективное когортное исследование с более чем 500 000 участников в возрасте от 40 до 69 лет на момент набора (2006–2010). Биобанк содержит различную информацию, связанную со здоровьем участников, включая медицинские записи, визуализацию, показатели образа жизни, когнитивные функции, биомаркеры из крови и мочи и многое другое.18 Данные о генотипе вмененный геном доступны для всех участников, включая информацию о структуре популяции, родстве и качестве уровня генотипа. Полное описание анализа данных о генотипах и подробная информация о контроле качества представлены в документе Bycroft et al.19 Вкратце, было проведено несколько тестов для контроля качества на основе маркеров (QC), включая тесты на эффекты партии, эффекты пластин, отклонения от равновесия Харди-Вайнберга (HWE; П < 10−6), эффекты пола, эффекты массива и несоответствие между репликами элементов управления. После этого проводился КК на основе выборки, включая тесты на несоответствие пола и крайнюю гетерозиготность и высокие показатели пропуска (>0,05). Предварительное вменение, анализ главных компонентов (PCA) проводился как в маркерном, так и в образце QC. В британском биобанке до вменения было 812 428 маркеров до QC и 805 426 маркеров, оставшихся после QC. Было идентифицировано подмножество этнически подобранных образцов с британским происхождением на основе PCA.19 В этом подмножестве обморок был определен с использованием кода Международной классификации болезней (МКБ)-9 780.2 и кода МКБ-10 R55. Случаи не были исключены из-за других сопутствующих заболеваний.

2.2 Когорта репликации, Консорциум интегративных психиатрических исследований

С 1981 года все новорожденные дети в Дании имеют образцы высушенных пятн крови, собранные для датского биобанка неонатального скрининга (DNSB) в Институте сыворотки Статенса (SSI). Консорциум интегративных психиатрических исследований (iPSYCH) представляет собой популяционное исследование, отобранное из когорты рождения, состоящей из всех синглтонных людей, родившихся в период с 1981 по 2005 год(n = 1 472 762). Всего было отобрано 86 189 особей. При этом 30 000 человек были случайным образом выбраны для представления общей популяции, а у 57 764 человек был диагностирован по крайней мере один из шести основных психиатрических диагнозов (синдром дефицита внимания / гиперактивности, нервная анорексия, расстройство аутистического спектра, аффективное расстройство, биполярное аффективное расстройство или шизофрения). Психиатрические заболевания были идентифицированы с использованием их уникального регистрационного номера, который позволяет свяживаться с Национальным реестром пациентов и Психиатрическим центральным исследовательским реестром, в котором диагнозы кодируются в соответствии с 10-й редакцией МКБ (МКБ-10). Диагнозы до 1994 года были закодированы в соответствии с МКБ 8-й редакции и преобразованы в эквивалентные коды МКБ-10.

Высушенные пятна крови были получены из DNSB для генотипирования выбранных пациентов(n = 86 189), как описано ранее Pedersen et al.20 Генотипирование проводилось в Институте Броуда на массиве Infinium PsychChip v1.0. Обработка ДНК, генотипирование, включая вменение, была успешной на 77 639 образцах.

Однонуклеотидные полиморфизмы (SFP; n = 246 369) были поэтапно преобразованы в гаплотипы с использованием SHAPEIT3 и вменелись с использованием Impute 2 со ссылоспособными гаплотипами из фазы 3 проекта 1000 Genomes, в результате чего было получено в общей сложности 8 018 013 вмененных вариантов. В качестве меры контроля качества варианты с качеством вменения (INFO <0,2), отклонения от HWE(P < 1 × 10−6), ассоциация с партией вменения (P < 5 × 10−8), различающееся качество вменения в различных случаях и контрольных случаях(P < 1 × 10−6), и были исключены частоты минорных аллелей (МАФ) <0,01. На уровне выборки контроль проводился на аномальной гетерозиготности выборки, высоких уровнях отсутствующих генотипов (>1%), половом соответствии, несоответствиях между дублирующимися образцами и родстве выборки. Надежный алгоритм PCA и KING использовался для идентификации подмножества неродственных этнически подобранных лиц, как описано ранее Schork et al.21 Обморок и коллапс определялись кодом МКБ-8 782.5 или кодом МКБ-10 R55.

2.3 Браузер PheWeb

Мичиганский браузер PheWeb22 является общедоступным ресурсом, созданным из общефеномных ассоциаций с использованием британского биобанка, который содержит 1403 внутренних определенных двоичных признака (номер заявки биобанка Великобритании 24460). В браузере PheWeb использовались только варианты с MAF >0,01 и информационной оценкой >0,3.23

2.4 Оценка статистической мощности

При оценочной распространенности заболевания 0,01, ∼9000 случаев и 100 000 контрольных в исследуемой когорте, соотношении шансов (OR) 2 и значительном значении P,определяемом как менее 0,05/1403 (признаки в PheWeb), частота аллелей заболевания выше 0,01 необходима для получения мощности 0,9. Исходя из этого, были исключены варианты с <0,01 МАФ.

2.5 Статистический анализ

В когорте биобанков Великобритании была реализована логистическая смешанная модель в рамках метода Scalable and Precise Implementation и Generalized mixed model (SAIGE).23 Это позволяет иметь в модели родственных лиц. SAIGE также контролирует завышенные ошибки типа 1, которые в противном случае могут возникнуть при несбалансированных соотношениях случай-контроль в логистических смешанных моделях. SAIGE сначала генерирует оценки родства и нулевую модель. После этого нулевая модель оснащается соответствующим SNP, матрицей генетического родства и поправкой на возраст при наборе, пол, массив и основные компоненты 1–4.

В подмножестве когорт iPSYCH основной шкалой времени был возраст. Наблюдение началось в возрасте одного года, и все люди были связаны с обмороком, смертью, эмиграцией или 30 апреля 2017 года, которые когда-либо происходили первыми. Связь между генотипом и риском обморока оценивалась с помощью регрессионного анализа Кокса с поправкой на пол. Абсолютный риск обморока и коллапса был предсказана на времени регрессионной модели Кокса со смертью в качестве конкурирующего риска. Абсолютный риск иллюстрируется как кумулятивная заболеваемость, стратифицированная по генотипу и полу. Мы не обнаружили нарушений в предположениях пропорциональной модели опасности (Дополнительная информация). Мы также воспроизвели значимые ассоциации, используя логистическую регрессию, скорректированную на возраст, пол и десять первых основных компонентов.

2.6 Разбиение на наследственности

Секционированная регрессия неравновесного балла (LDSC) использовалась для оценки наследуютемости, относящейся к группам клеточного типа и аннотациям клеточного типа H3K4Me1, как описано Finucane et al.24 Основная область гистосовместимости (MHC-область; chr6:25-35Mb) была исключена из анализа. Мы использовали ранее рассчитанные показатели неравновесия связей LD и частоты аллелей на основе данных проекта 1000 Genomes с европейским происхождением (см. URL-адреса).

Типы клеток были сгруппированы в: надпочечники / поджелудочная железа, сердечно-сосудистая, центральная нервная система, соединительная кость, желудочно-кишечный тракт, кроветворение, почки, печень, скелетные мышцы и другие. Аннотации из H3K4Me1 вменяемых пиков были основаны на данных Roadmap Epigenomics Mapping Consortium,25 как описано Демонтисом и др.26

Авторы LDSC (см. URL-адреса)утверждают, что сводная статистика смешанных моделей не должна использоваться для оценки SNP-наводимости, но может использоваться для генетической корреляции и секционированной на наследственности. Это общегеномное ассоциативное исследование (GWAS) анализируется с помощью смешанной модельной регрессии. Поэтому мы не оценивали перехват и на гермитируемость SNP.

2.7 Генетические корреляции обморока и коллапса с другими признаками

Мы исследовали генетическую корреляцию(rg)обморока и коллапса с 20 другими признаками, используя LDSC.27 Признаки были отобраны на основе наличия соответствующих сводных статистических данных, широко распространенности, актуальности для общественного здравоохранения и, если считается, что они имеют биологическую правдоподобную корреляцию с обмороком (Дополнительные материалы онлайн, Данные S1). Область MHC и SFP со средним значением MAF <0,05 были исключены из анализов и только фенотипы со средним значением χ2 рассмотрены >1.02. В регрессии использовались предварительно вычисленные оценки LD для SSP HapMap3 (см. URL-адреса). Мы применили коррекцию Бонферрони, и P < 0,05/20 была признана значительной.

2.8 Обогащение генного набора

Мы провели анализ обогащения генов с использованием двух независимых методов, MAGMA v1.628 и MAGENTA v1.2.29 Цель состояла в том, чтобы проверить обогащение эквивалентными биологическими путями с использованием обоих методов. В анализы были включены только аутосомные SMP, исключая область MHC, с > MAF 0,01. Наборы генов варьировались от 10 до 1000 генов. Для MAGMA фаза 3 проекта 1000 геномов использовалась в качестве эталонной панели и наборов генов(n = 10 655) из MsigDB v5.2,30 с окном генов 5 кб на каждом конце генных интервалов. Настройки по умолчанию использовались для анализов с использованием MAGENTA с комбинированным набором генов (GO, Panther, Ingenuity, KEGG, Reactome, Biocarta; n = 10 992).

2.9 Биологическая и функциональная аннотация

Функциональное отображение и аннотация были сделаны с использованием FUMA v1.3.31 Общегеномные значимые SFP с самыми низкими P и r2 < 0,6 друг от друга были определены как различные значимые SFP и использовались для определения границы локуса геномного риска.31 Свинцовый SFP определялся теми же условиями, но с r2 < 0.1. Попарная структура SFP была основана на фазе 3 проекта 1000 геномов.32 Вариантная аннотация для каждого локуса была сделана на различных значимых SFP и SFP в LD с ними, с максимальным расстоянием 250 kb и P < 0,05, называемых кандидатами SFP. Генное картирование аннотированных SFP было основано на геномном положении (максимальное расстояние 10 kb), количественных локусах экспрессии признаков (eQTL) и исследованиях взаимодействия хроматинов. EQTL были идентифицированы из GTEx v.7 с коэффициентом ложного обнаружения (FDR) <0,05. Аннотированным SFP были присвоены состояния взаимодействия хроматина (порог FDR <10−6, 500 bp промотора области window) на основе наиболее распространенного из 15-состояния хром-ХММ по 127 типам клеток из данных эпигеномики Roadmap.25

2.10 Анализ ассоциаций по перекрестным признакам

Чтобы оценить плейотропные эффекты идентифицированных SOP, мы провели общефеномное ассоциативное исследование (PheWAS) по 13 различным признакам (включая обморок), связанным с аритмиями, сердечно-сосудистыми заболеваниями, психическими расстройствами, неврологическими и метаболическими заболеваниями (см. Дополнительные материалы онлайн, Данные S2; см. URL-адреса). Мы рассмотрели связь между различными значимыми SFP и вышеупомянутыми чертами. Затем мы исследовали плейотропию десяти лучших связанных свинцовых SFP в каждом из этих признаков. Пороговое значение P для свинцовых SFP было установлено на P < 1 × 10−6. Свинцовые SFP были идентифицированы с помощью СОП, слипающихся ЛД, в PLINK v1.933 с r2 > 0,1 и физическое расстояние 1500 кб. Чтобы избежать случайной идентификации тех же или близлежащих локусов риска, мы использовали большой порог физического расстояния при слипание.

2.11 Связь экспрессии генов и риска обморока

Мы использовали MetaXcan34 исследовать опосредующие эффекты уровней экспрессии генов на обморок и коллапс. MetaXcan выполняет анализ на основе генов, основанных на ассоциациях прогнозируемой экспрессии генов и риска фенотипа, используя сводную статистику и данные eQTL. Мы использовали предварительно вычисленную модель прогнозирования транскриптома, основанную на GTEx v.7 и ковариации проекта 1000 Genomes (см. URL-адреса)и настройках программного обеспечения по умолчанию. Результаты MetaXcan были дополнены анализом колокализации eQTL с использованием Шерлока.35 Шерлок использует байесовскую структуру для сопоставления ассоциаций GWAS с сигналами гена eQTL. Значительное перекрытие локуса, связанного с фенотипом, и eQTL гена подразумевает вероятную функциональную роль этого гена в фенотипе.

2.12 Количественная полимеразная цепная реакция

Чтобы оценить экспрессию генов в тканях, мы провели количественные эксперименты полимеразной цепной реакции (qPCR) на 12-15-недельных самцах крыс Wistar из Taconic (Эйби, Дания), усыпленных вывихом шейки матки. Эксперименты проводились в соответствии с законодательством Европейского Союза по защите животных, используемых в научных целях, и одобрены Датской национальной инспекцией экспериментов на животных.

Экстракция РНК, обратная транскрипция и анализ qPCR были выполнены так, как описано ранее.36 Короче говоря, РНК была выделена из мозговых артерий, мозга и сердца с помощью RNeasy Micro Kit (Qiagen, Дания). Обратная транскрипция была выполнена в соответствии с инструкциями производителя с помощью комплекта Nanoscript 2 (Primerdesign, Великобритания). qPCR проводили с 25 нг кДНК на скважину и концентрацией праймера 250 нМ с использованием зеленого мастермикса Precision-iC SYBR (Primerdesign, Великобритания) с системой обнаружения ПЦР CFX96 Real-Time (Bio-Rad, Дания). Наиболее стабильные эталонные гены были определены с помощью анализа geNorm (Biogazelle qbase+) и были обнаружены как актин бета, топоизомераза I и кальнексин. Средние значения Cq этих эталонных генов были использованы для определения относительного обилия гена цинкового пальца 804A(ZNF804A). Грунтовки для ZNF804A были разработаны собственной компанией и синтезированы tag Copenhagen A/S (Дания) со следующими последовательностями: sense—5′-CGCTGCCCATGTTGTATCTA-3′; анти-смысл — 5’CCCACGATGATGATACCGACATAAC-3′. Использовались следующие условия циклирования: начальная активация при 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин, и данные собирались во время каждой фазы цикла. Анализ кривой расплава, чтобы убедиться, что каждый набор грунтовок усиливает один, конкретный продукт, завершил протокол.

3. Результаты

3.1 Общегеномный значительно ассоциированный локус риска обморока

В подмножестве биобанка Великобритании было 408 961 этнически подобранных лиц, с 9163 случаями и 399 798 контрольными группами. Используя логистическую смешанную модель регрессии, родственные коэффициенты родства, основные компоненты, пол и возраст при наборе были включены в качестве ковариатов (коэффициент геномной инфляции λ = 1,07; Рисунок 1Дополнительные материалы онлайн, рисунок S1). Мы идентифицировали один новый геномный значимый локус в хромосоме 2q32.1 [свинец SNP rs12465214, OR = 1,13 для аллеля риска C, 95% доверительный интервал (CI) 1,10–1,17, P = 5,8 × 10−15]. В общей сложности мы выявили пять различных значимых SSP, находящихся в одном и том же локусе (rs12465214, rs7593266, rs17582219, rs12621296, rs2219224; Таблица 1Дополнительные материалы онлайн, рисунок S2).

Рисунок 1
Манхэттенский участок. Манхэттенский график, показывающий связь однонуклеотидных полиморфизмов (SFP) с обмороком и коллапсом в общегеномном исследовании ассоциаций 9163 случаев и 399 798 контрольных. Серая пунктирная горизонтальная линия отмечает порог значимости всего генома (P = 5 × 10−8). Статистическая значимость SFP показана на оси y как −log10(P) как функция хромосомного положения (ось x). P-значения калибруются из оценочного теста с приближением седловой точки.
 
Манхэттенский участок. Манхэттенский график, показывающий связь однонуклеотидных полиморфизмов (SFP) с обмороком и коллапсом в общегеномном исследовании ассоциаций 9163 случаев и 399 798 контрольных. Серая пунктирная горизонтальная линия отмечает порог значимости всего генома (P = 5 × 10−8). Статистическая значимость SFP показана на оси yкак −log10(P) как функция хромосомного положения (осьx).P-значениякалибруются из оценочного теста с приближением седловой точки.

 

3.2 Репликация локуса GWAS

В подмножестве iPSYCH мы проанализировали 54 656 человек. В общей сложности 2352 обморока произошли в течение среднего наблюдения 24,86 лет (межквартильный диапазон 19,62–29,97). Средний возраст начала обморока — 18,2 года. Было 51 929 элементов управления. Пример обзора можно найти в разделе Таблица 2. Для rs12465214 мы обнаружили повышенное отношение риска (HR) обморока и коллапса для референтной группы (CC) по сравнению с гомозиготными носителями (AA, HR = 1,30, 95% ДИ 1,15–1,46, P < 0,001) и по сравнению с гетерозиготными носителями (CA, HR = 1,15, 95% ДИ 1,03–1,28, P = 0,02) (Рисунок 2). У женщин был почти вдвое выше риск обморока по сравнению с мужчинами (ОР = 1,93, 95% ДИ = 1,77–2,10, P < 0,001) (Рисунок 2).

 

Рисунок 2

Регрессионный модель Кокса. Кумулятивная частота обмороков и коллапсов, стратифицированных по генотипу и полу. Всего произошло 2352 обморока и коллапса у 54 656 человек. Оценки были основаны на регрессионной модели Кокса с учетом конкурирующего риска смерти.

 

Регрессионный модель Кокса. Кумулятивная частота обмороков и коллапсов, стратифицированных по генотипу и полу. Всего произошло 2352 обморока и коллапса у 54 656 человек. Оценки были основаны на регрессионной модели Кокса с учетом конкурирующего риска смерти.

 

Таблица 2

 

 Событие синкопаНет синкопа
Женский1564 24 006 
Мужской788 27 923 
Средний возраст (IQR)27.8 (8.1) 24.7 (10.4) 

 

Исходные характеристики когорты iPSYCH в конце наблюдения, без лиц, которые умерли во время наблюдения.

 

iPSYCH, Консорциум интегративных психиатрических исследований; IQR, межквартильный диапазон; SD, стандартное отклонение.

При логистической регрессии размер эффекта свинцового SNP был сопоставим с основным выводом в UK Biobank (аллель риска C, OR = 1,13, 95% ДИ 1,07–1,18, P = 8,82 × 10−6).

3.3 Генетическая корреляция с другими признаками

Мы обнаружили значительную генетическую корреляцию(rg)с девятью из 20 фенотипов, и еще пять достигли номинальной значимости (Рисунок 3Дополнительные материалы онлайн, Данные S3). Общий рейтинг здоровья (более высокий рейтинг указывает на ухудшение здоровья) был наиболее коррелирован фенотипом(rg = 0,43, P = 9,63 × 10−16). Это было поддержано отрицательной корреляцией с силой захвата руки (rg = −0,18, P = 8,75 × 10−4), прокси-сервер общего состояния здоровья.37 Генетическое перекрытие с ишемической болезнью сердца (rg = 0,41, P = 6,99 × 10−15) была обоснована значимой корреляцией с родственными признаками, такими как стенокардия, гипертония, индекс массы тела и фибрилляция предсердий (Рисунок 3). Тревога была сильно коррелирована с обмороком, но с широкой средней стандартной погрешностью (SE) и корреляция не достигла порога Бонферрони(rg = 0,67, P = 2,53 × 10−3). Тревога имела среднее значение χ2 1,0298, что указывает на низкий полигенетический сигнал. Поэтому rg к тревоге довольно ненадежен. Два других психиатрических фенотипа, синдром дефицита внимания и гиперактивности(rg = 0,20, P = 2,16 × 10−3) и депрессия (rg = 0,15, P = 2,32 × 10−3), продемонстрировал значительное генетическое перекрытие с обмороком. Высота продемонстрировала небольшую отрицательную корреляцию с обмороком (rg = −0,10, P = 8,03 × 10−3). Однако эта связь не была значимой после корректировки Бонферрони.

Рисунок 3
Генетическая корреляция. Регрессия оценки LD, выявляющая генетическую корреляцию с обмороком и коллапсом (9163 случая и 399 798 контрольных) и другими фенотипами. Размеры выборки внешних исследований геномных ассоциаций показаны в Дополнительном материале онлайн, Данные S1. Фенотипы с отрицательным log10(P) отображаются по оси Y. Ось X показывает генетическую корреляцию (rg). Точки представляют собой оценочные значения с толстыми линиями, указывающими на средню стандартную погрешность (SE), и тонкими линиями 1,96 × SE. Значительная ассоциация после поправок Бонферрони обозначается зеленым цветом. Номинальная значимость обозначается фиолетовым цветом и несущественными корреляциями с серым. Стандартные ошибки и P-значения были получены в результате использования блочного ресамплинга jackknife.

Генетическая корреляция. Регрессия оценки LD, выявляющая генетическую корреляцию с обмороком и коллапсом (9163 случая и 399 798 контрольных) и другими фенотипами. Размеры выборки внешних общегеномных ассоциативных исследований показаны в Дополнительные материалы онлайнДанные S1. Фенотипы с отрицательным log10(P) отображаются на оси y. Ось Xпоказывает генетическую корреляцию (rg). Точки представляют собой оценочные значения с толстыми линиями, указывающими на средню стандартную погрешность (SE), и тонкими линиями 1,96 × SE. Значительная ассоциация после поправок Бонферрони обозначается зеленым цветом. Номинальная значимость обозначается фиолетовым цветом и несущественными корреляциями с серым. Стандартные ошибки и P-значениябыли получены в результате использования блочного ресамплинга jackknife.

3.4 Специфические анализы клеточного типа

Annotations for ten cell types and H3K4Me1 cell-type annotations from Roadmap were used to estimate partitioned heritability of syncope and collapse into functional categories, as described by Finucane et al.24 Обнаружено значительное обогащение SFP, расположенных в регуляторных элементах надпочечников и поджелудочной железы (обогащение = 7,03, SE = 2,12, P = 1 × 10−3Дополнительные материалы онлайн, рисунок S4, данные S4). Принимая во внимание, что анализ секционированной наводимости, основанный на вмененных пиковых пиков от H3K4Me1, не выявил каких-либо значимых аннотаций клеточного типа H3K4Me1 (Дополнительные материалы онлайн, рисунок S5, данные S5).

3.5 Функциональная аннотация

На основе ведущей SNP и различных значимых SNP в локусе риска было идентифицировано и аннотировано 244 SNP-кандидата (Дополнительные материалы онлайн, Данные S6). Пять SNP (rs7349369, rs716544, rs12473165, rs12478223, rs12468883), в LD с отчетливо значимым SNP rs2219224 были наивно сопоставлены по положению (геномное расстояние <10 кб) к MIR548AE1. В GTEx v.7 134 SFP-кандидата были связаны с экспрессией генов (eQTL; Рузвельт >10−3Рисунок 4Дополнительные материалы онлайн, рисунок S2, данные S7). eQTL были преимущественно сопоставлены в ткани щитовидной железы с соседним геном ZNF804A,с самой сильной ассоциацией для rs67219359 (P = 4 × 10−8р2 с rs12465214 = 0,77). Локус риска имел несколько значительных взаимодействий хроматина, наблюдаемых по данным Hi-C (n = 1588; Рузвельт <10−6), с 210 взаимодействиями хроматина, картируя региональные гены (Рисунок 4Дополнительные материалы онлайн, Данные S8). В общей сложности 26 генов отображены в локус риска через позиционные, eQTL и хроматиновые взаимодействия (Дополнительные материалы онлайн, Данные S9). Десять генов кодировали белок, причем ген ZNF804A продемонстрировал самые убедительные доказательства взаимодействия с локусом риска.

 

Рисунок 4
Цирко-график, отображающий взаимодействие eQTL и хроматина для локуса риска. Самый внешний слой показывает региональный график, отображающий rsID свинцовых SCP. Высота оси Y указывает на значимость в отрицательной шкале log10. Отображаются только SMP с P < 0,05. SFP в локусах геномного риска имеют цветовую кодировку в качестве функции их максимального r2 к одному из различных значимых SFP в локусе следующим образом: красный (r2 > 0,8), оранжевый (r2 > 0,6), зеленый (r2 > 0,4) и синий (r2 > 0,2). SFP, которые не находятся в LD ни с одной из независимых значимых SFP (с r2 ≤ 0,2), серые. Второй слой показывает хромосому с локусами геномного риска, выделенными синим цветом. Отображаются только отображенные гены по взаимодействию хроматина и/или eQTL. Если ген и связи отображаются только взаимодействиями хроматина или только eQTL, он окрашен в оранжевый или зеленый цвет соответственно. Когда ген нанесен на карту обоими, он окрашен в красный цвет.

Цирко-график, отображающий взаимодействие eQTL и хроматина для локуса риска. Самый внешний слой показывает региональный график, отображающий rsID свинцовых SCP. Высота оси yуказывает на значимость в отрицательной шкале log10. Отображаются только SMP с P < 0,05. SFP в локусах геномного риска имеют цветовую кодировку в функции их максимального r2 к одному из отчетливых значимых SFP в локусе, а именно: красный (r2 > 0.8), оранжевый (r2 > 0.6), зеленый (r2 > 0,4) и синий (r2 > 0.2). SSP, которые не находятся в LD ни с одной из независимых значимых SPS (с r2 ≤ 0.2) серые. Второй слой показывает хромосому с локусами геномного риска, выделенными синим цветом. Отображаются только отображенные гены по взаимодействию хроматина и/или eQTL. Если ген и связи отображаются только взаимодействиями хроматина или только eQTL, он окрашен в оранжевый или зеленый цвет соответственно. Когда ген нанесен на карту обоими, он окрашен в красный цвет.

Анализ обогащения генных наборов с помощью MAGMA и MAGENTA не выявил каких-либо значимых наборов генов.

3.6 Анализ всего транскриптома

Поскольку все, кроме одного из 134 кандидатов SFP, связанных с eQTL, были идентифицированы в ткани щитовидной железы, мы использовали модель транскриптома ткани щитовидной железы GTEx v.7(n = 344; см. URL-адреса)для анализа MetaXcan. Анализ выявил значительную связь между прогнозируемой экспрессией генов ZNF804A и обмороком и коллапсом (размер эффекта = −0,63, дисперсия экспрессии генов = 0,012, P = 1,04 × 10−10Рисунок 5Дополнительные материалы онлайн, Данные S10). Анализ eQTL с Шерлоком выявил значительную колокализацию с локусом риска и ZNF804A (P = 1,92 × 10−5Дополнительные материалы онлайн, Данные S11).

 

Рисунок 5
Вулканический график анализа транскриптома. График, показывающий результаты анализа транскриптома MetaXcan на основе ткани щитовидной железы GTEx v.7 (n = 323) и сводной статистики обмороков и коллапсов (9163 случая и 399 798 контрольных). Размер эффекта, связанного с увеличением или уменьшением экспрессии с риском обморока, показан на оси X. Ось Y показывает −log10(P) для каждого тестируемого гена. Пунктирная линия указывает на порог Бонферрони (P = 0,05/9504). Гены с отрицательным эффектом и значительной ассоциацией обозначены как синие точки. Незначимые гены обозначены как серые точки. Значимость оценивалась (P-значения) с помощью тестов Вальда.

Вулканический график анализа транскриптома. График, показывающий результаты анализа транскриптома MetaXcan на основе ткани щитовидной железы GTEx v.7(n = 323) и сводной статистики обмороков и коллапсов (9163 случая и 399 798 контрольных). Размер эффекта, связанного с увеличением или уменьшением экспрессии с риском обморока, показан на оси x. Ось yпоказывает −log10(P) для каждого тестируемого гена. Пунктирная линия указывает порог Бонферрони(P = 0,05/9504). Гены с отрицательным эффектом и значительной ассоциацией обозначены как синие точки. Незначимые гены обозначены как серые точки. Значимость оценивалась(P-значения)с помощью тестов Вальда.

3.7 Ассоциации перекрестных признаков

PheWAS выявил значительную связь между свинцовой SNP rs12465214 и гипертонией(P = 2,12 × 10−3Дополнительные материалы онлайн, рисунок S6 и данные S12).

Верхние свинцовые SFP, извлеченные из других фенотипов, не выявили каких-либо перекрестных ассоциаций признаков с обмороком и коллапсом. Однако при иерархической кластеризации обмороки группировались наиболее близко к эпилепсии, рецидивирующим припадкам и судорогам (Дополнительные материалы онлайн, рисунок S7).

Ген ZNF804A ранее ассоциировался с шизофренией через GWAS. Поэтому мы вручную искали ассоциации rs12465214, rs7593266, rs17582219, rs12621296 и rs2219224 в шизофрении GWAS Рипке и др.38 Ни один из этих SSP не имел номинальной значимой ассоциации (Дополнительные материалы онлайн, Данные S13).

3.8 qPCR анализ

Анализ qPCR показал, что ZNF804A наиболее обильно экспрессировался в ткани мозга. Экспрессия также была обнаружена в мозговых артериях, хотя и на более низком уровне. Выражение ZNF804A было незначительным в сердце (Рисунок 6).

 

Рисунок 6
Анализ экспрессии генов. Относительная экспрессия ZNF804A оценивается путем анализа qPCR в тканях мозговых артерий (n = 5), головного мозга (n = 3) и сердца (n = 3) у крыс. Данные представляют собой среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). *P < 0,05, ***P < 0,001 по данным непарных т-тестов.

Анализ экспрессии генов. Относительная экспрессия ZNF804A оценивается путем анализа qPCR в тканях мозговых артерий(n = 5), головного мозга(n = 3) и сердца(n = 3) у крыс. Данные представляют собой среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). *P < 0,05, ***P < 0,001 по данным непарных t-тестов.

4. Обсуждение

Мы сообщаем о первом открытии общегеномного значимого локуса риска обморока и коллапса. Свинцовый SNP, rs12465214, находящийся в хромосоме 2q31.1, является интергенным вариантом примерно в 250 кб ниже гена ZNF804A (Дополнительные материалы онлайн, рисунок S2). Кандидаты SFP в этом локусе сопоставляются с 25 генами (десятью белковыми кодирующими) посредством позиционного картирования, eQTL или взаимодействия хроматина (Рисунок 4). Это говорит о значительной регуляторной роли локуса риска на близлежащих генах. Анализ eQTL в масштабах всего транскриптома показывает, что локус риска влияет на экспрессию гена ZNF804A (Рисунок 5). ZNF804A преимущественно экспрессируется в головном мозге, мозговых артериях и эндокринной ткани.39 Мы не нашли доказательств экспрессии в сердечной ткани. Экспрессия гена ZNF804A в человеческом мозге увеличивается от эмбриональной до ранней эмбриональной стадии и достигает пика около ранней средней стадии плода. В конце концов, уровень экспрессии гена ZNF804A снижается и остается постоянным во взрослом возрасте.40 Вполне возможно, что аномальная регуляция артериального давления или снижение мозговой перфузии регулируются в этом локусе, что может повлиять на риск обморока. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для оценки такой взаимосвязи. Гены белка цинкового пальца (ZNF) ранее были связаны с VVS. Гены ZNF28, ZNF845и ZNF146 были значительно переэкспрессированы в группе детей с VVS по сравнению с контрольной группой здоровых детей, соответствующих возрасту.41

Анализ секционированной на наследственности выявил значительное обогащение SFP в регуляторных элементах ткани надпочечников и поджелудочной железы (Дополнительные материалы онлайн, рисунок S4). Это обогащение может быть частично обусловлено обнаруженным локусом риска, предполагающим участие эндокринной системы в патогенезе обморока.

Анализ перекрестных признаков выявил связь между свинцовым SNP rs12465214 и гипертонией (Дополнительные материалы онлайн, рисунок S6). Это говорит о потенциальной функциональной связи между rs12465214 и регуляцией кровеносной системы, что может повлиять на риск обморока.

Ассоциация rs12465214 была воспроизведена в независимой когорте, где SNP была в значительной степени связана с инцидентом обморока. Мы также обнаружили, что у женщин была почти двойная ЧС для обморока по сравнению с мужчинами, подчеркивая гендерную разницу в риске обморока (Рисунок 2). Объясняется ли это различие фактическими различиями в генетическом риске обморока или отражает различия по признаку пола в поведении при обращении за медицинской помощью, неизвестно.

Мы наблюдали сильное генетическое совпадение между обмороком и самооценкой общего рейтинга здоровья, а также отрицательную корреляцию с силой захвата рук, что является показателем состояния здоровья.37 Это подтверждает представление о том, что обморок может быть предшественником или симптомом более тяжелого заболевания. Генетическое совпадение с несколькими сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) усиливает это понятие. Кроме того, общий генетический компонент, предрасполагая к этим признакам, предполагает сходные клеточные пути для участия в VVS и CVD.

Ранее rs1344706, в непосредственной близости от ZNF804A,был связан с шизофренией и биполярным расстройством.42 Локус риска, rs1344706, однако, не находится в LD с rs12465214 (r2 < 0.1). Ни один из пяти различных значимых SMP, которые были перечислены в этом исследовании, не имел номинально значимой связи(P < 0,05) с шизофренией в GWAS Ripke et al.38 Мы не обнаружили генетической корреляции между риском обморока и шизофренией (Рисунок 3). Изменения в гене ZNF804A были связаны с измененной функциональной связностью в нейронах. Нокдаун гена в нервных стволовых клетках человека или развивающихся нейронах приводит к измененной экспрессии генов, связанных с адгезией клеток, выростом нейритов, образованием синапсов, развитием синапсов и передачой сигналов цитокинов.43 Все упомянутые функциональные возможности были связаны с шизофренией.44 Кроме того, было показано, что ZNF804A взаимодействует с геном AXTN1.45 кодирование белка атаксина 1, который был связан со спиноцеребеллярной атаксией, характеризующейся дегенерацией клеток Пуркинье и потерей равновесия и координации.46

Предыдущие исследования в отношении VVS выявили полиморфизмы в гене α 1a-адренергическогорецептора(ADRA1A),47 ген β 1-адренорецепторов(ADRB1),14 ген, кодирующий альфа-субъединицу белка Gs(GNAS1),48 ген рецептора аденозина А2а(ADORA2A),15 и ген эндотелина 1(EDN1).16 Однако эти исследования были ограничены небольшими размерами выборки, и их результаты не были воспроизведены последовательно. Ни один из этих генов не был связан с обмороком и коллапсом в настоящем исследовании.

В настоящем исследовании существуют ограничения, которые необходимо устранить. Во-первых, определение фенотипа было основано на коде МКБ-10 для «обморока и коллапса», который не различает подтипы обморока. Использование кода МКБ-10 R55 для обморока и коллапса ранее было проверено, с положительным прогностическим значением 95%.49

Во-вторых, медикаментозное удлинение электрокардиографического интервала QT ранее было связано с повышенным риском обморока и внезапной необъяснимой смерти.50 Поэтому нельзя исключать побочные эффекты фармацевтических средств, способствующие склонности к обмороку.

Ген ZNF804A и связанные с ним пути должны быть исследованы, как в глубоко фенотипированных случаях обморока, случаях аритмии, так и в случаях с симптоматическими лекарственными взаимодействиями, включающими либо обморок, либо аритмию.

5. Выводы

Мы идентифицировали общегеномный значимый локус rs12465214, связанный с обмороком и коллапсом (P = 5,8 × 10−15). Этот вывод был воспроизведен в независимой когорте. Анализ eQTL указал на ген ZNF804A, который, как было обнаружено, экспрессируется в мозге и мозговых артериях крыс. Необходимы дальнейшие генетические и функциональные исследования, чтобы понять молекулярный механизм связи между SNP и обмороком и коллапсом.

Читайте также

Подпишитесь на рассылку по email и Вы будете одними из первых получать новости и свежую нормативно-правовую базу в области личной и промышленной безопасности.

Заказать звонок

Оставьте свой номер и мы перезвоним Вам,
подберем для Вас оптимальное решение.